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粪便 DNA 提取的技巧
人阅读 发布时间：2019-12-23 11:59
粪便和微生物菌群
在过去的十年里，人类微生物学研究的数量呈爆炸式增长，其中大部分是对粪便样本进行分析。虽然这不是最令人愉快的工作样本，但我们可以从粪便中了解到很多关于人类健康和生物学的知识。这些被消化的废物和微生物的基质中含有微生物群落影响我们健康的多种方式的线索。例如，我们肠道中携带的微生物群落的失调可以是多种多样的，从外来病原体的明显感染到导致症状的共生体的细微变化。
粪便样本中发现的微生物基因组 DNA 对微生物组研究具有重要意义。尽管科学家们一直在不断改进 DNA 提取技术，但在样品纯化方面仍存在许多挑战。这些挑战包括有偏差的微生物裂解、PCR 抑制剂的污染以及粪便基质的变化 (硬、软、腹泻等)。粪便 DNA 提取需要解决这些主要问题，以获得纯净、无抑制作用的 DNA，同时保持高的产量。
每个生物体的粪便样品，结果好坏参半
粪便样本的形状、大小和一致性各不相同，可能受到各种因素的影响。供体的种类、健康状况和饮食习惯都会造成粪便成分的差异。这导致了在质量、一致性和微生物群落组成方面的巨大差异。
因此，重要的是要有一个非常完整的纯化流程，以确保微生物 DNA 可以从所有类型的样本中分离出来。理想的提取体系能有效地分离革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株以及古生菌和真菌，且不引入任何偏见。相反，使用有偏倚的方法提取的细菌 DNA 可能会对数据分析造成严重后果，并导致不正确的数据解释。通常，这些偏倚表现为对易溶菌的不准确的过度表达，以及随后对难溶菌的低表达。
即使在许多纯化流程中遇到各种各样的问题，以下技巧也可以确保成功地从粪便中提取 DNA:
把样品裂解
• 积少成多
* 每个样品都有不同的生物量和细菌的丰富度，因此在提取方法中使用适当数量的样品是至关重要的。粪便往往含有非常丰富的细菌 DNA 含量，所以你不需要太多 !
* 试着从 1 毫克的健康大便开始，逐渐增加到更高的量。通常，100 毫克可以产生 15-25 微克的 DNA(取决于样本)。
• 对于非常厚或粘稠的样品，重新悬浮和稀释成保存试剂，如 DNA/RNA Shield 将有助于提取步骤，同时保存微生物剖面。
* 另外，用 DNase/RNase 游离水或 PBS 等盐溶液稀释样品也有助于提取。但是，如果不立即提取，使用水或 PBS 会导致微生物细胞裂解，释放 DNases 和 RNases，并降解微生物 DNA。此外，如果样品被冷冻保存，水和 PBS 不会保护样品免受冻融偏差的影响。这些样品在裂解前也可以通过破碎仪（如我公司产品 TI2019 破碎仪）进行彻底的均质。
• 注意微生物的生长 ! 在收集和运送到实验室进行提取之前的时间内，微生物种群可能会随着它们在收集管中的生长而发生变化。有几件事你可以做，以确保增长不会发生使你的结果产生偏差:
* 使用样本存储试剂 (如 DNA/RNA Shield)
* 收集时溶解
* 收集后立即冻结样本 (尽管参阅上面关于存储和冻结 / 解冻偏差的警告)(图 1)
• 对于非常粘稠的样品或抑制物质含量较高的样品，考虑使用比通常更少的样品，以避免在 PCR 抑制剂中处理。
* 食草动物 (例如马和喂食谷物的老鼠) 的样本往往含有很高的碳水化合物和未消化的植物物质。考虑像处理植物一样处理这些样本，并在净化前进行预处理 CTAB 萃取来去除这些碳水化合物。
• 水样粪便需要通过移液管转移到裂解管中。
纯化
DNA 纯度对成功的下游分析至关重要。如果在隔离期间不确保样品没有污染物，将需要额外的处理步骤。
纯样品的秘密在于纯化方案的结合和洗涤步骤。大多数纯化试剂盒 (包括 Quick-Dna 粪便土壤微生物试剂盒) 中含有的结合剂是一种高度饱和的潮性盐溶液。虽然将 DNA 与纯化基质结合至关重要，但如果该试剂与 DNA 共洗脱，则会在 230 纳米处产生高吸收率，从而使纳米液滴测量结果发生偏差。此外，粪便样本可能含有高水平的多酚化合物，可共同提取 DNA。在使用聚合酶链反应 (PCR) 进行步骤之前，应注意确保这些物质被去除，因为它们会抑制该技术。
为避免这些问题，我们建议：
1. 在操作步骤的结合步骤中，不要过度填充柱。任何额外的结合缓冲液都可能使盐滞留在柱的边缘或顶部。此外，柱顶被过量装载的样品污染的可能性也更大。
2. 在洗涤步骤中，洗涤缓冲液应沿柱的边缘加载，而不是简单地将其喷射到柱中。沿着柱的内缘运行移液管尖端，有助于将盐从柱壁上洗去。
3. 将洗脱缓冲液直接放在基质上。用移液管将洗脱缓冲液移至柱上的任何其他位置，都可能导致任何残留盐的再悬浮。
4. 粪样中含有胆盐和与复合多糖，他们与 DNA1,2 相互作用，这些化合物抑制 PCR，因此需要在下游过程中去除 (图 2)。如果需要，洗脱的 DNA 应通过抑制剂去除柱，如一步法 PCR 抑制剂去除试剂盒 (OneStep PCR Inhibitor Removal Kits)
一步 PCR 抑制剂去除试剂盒
OneStep PCR Inhibitor Removal Kits
一步法 PCR 抑制剂去除试剂盒是 PCR 抑制剂清除试剂盒，包含所有有效去除污染物所需的成分，这些污染物可以抑制 DNA 和 RNA 制剂的下游酶反应 (如 PCR 和 RT)。这些 PCR 抑制剂净化试剂盒中的柱状基质是专门设计用于从最不纯净的 DNA 和 RNA 制剂中有效去除多酚类化合物、腐殖酸 / 黄腐酸、单宁、黑色素等。使用这些 PCR 抑制纯化试剂盒，样品纯化就像结合，纯化柱中回收样品一样简单。
如有相关产品问题，欢迎咨询 吕经理 13302085668
在过去的十年里，人类微生物学研究的数量呈爆炸式增长，其中大部分是对粪便样本进行分析。虽然这不是最令人愉快的工作样本，但我们可以从粪便中了解到很多关于人类健康和生物学的知识。这些被消化的废物和微生物的基质中含有微生物群落影响我们健康的多种方式的线索。例如，我们肠道中携带的微生物群落的失调可以是多种多样的，从外来病原体的明显感染到导致症状的共生体的细微变化。
粪便样本中发现的微生物基因组 DNA 对微生物组研究具有重要意义。尽管科学家们一直在不断改进 DNA 提取技术，但在样品纯化方面仍存在许多挑战。这些挑战包括有偏差的微生物裂解、PCR 抑制剂的污染以及粪便基质的变化 (硬、软、腹泻等)。粪便 DNA 提取需要解决这些主要问题，以获得纯净、无抑制作用的 DNA，同时保持高的产量。
每个生物体的粪便样品，结果好坏参半
粪便样本的形状、大小和一致性各不相同，可能受到各种因素的影响。供体的种类、健康状况和饮食习惯都会造成粪便成分的差异。这导致了在质量、一致性和微生物群落组成方面的巨大差异。
因此，重要的是要有一个非常完整的纯化流程，以确保微生物 DNA 可以从所有类型的样本中分离出来。理想的提取体系能有效地分离革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株以及古生菌和真菌，且不引入任何偏见。相反，使用有偏倚的方法提取的细菌 DNA 可能会对数据分析造成严重后果，并导致不正确的数据解释。通常，这些偏倚表现为对易溶菌的不准确的过度表达，以及随后对难溶菌的低表达。
即使在许多纯化流程中遇到各种各样的问题，以下技巧也可以确保成功地从粪便中提取 DNA:
把样品裂解
• 积少成多
* 每个样品都有不同的生物量和细菌的丰富度，因此在提取方法中使用适当数量的样品是至关重要的。粪便往往含有非常丰富的细菌 DNA 含量，所以你不需要太多 !
* 试着从 1 毫克的健康大便开始，逐渐增加到更高的量。通常，100 毫克可以产生 15-25 微克的 DNA(取决于样本)。
• 对于非常厚或粘稠的样品，重新悬浮和稀释成保存试剂，如 DNA/RNA Shield 将有助于提取步骤，同时保存微生物剖面。
* 另外，用 DNase/RNase 游离水或 PBS 等盐溶液稀释样品也有助于提取。但是，如果不立即提取，使用水或 PBS 会导致微生物细胞裂解，释放 DNases 和 RNases，并降解微生物 DNA。此外，如果样品被冷冻保存，水和 PBS 不会保护样品免受冻融偏差的影响。这些样品在裂解前也可以通过破碎仪（如我公司产品 TI2019 破碎仪）进行彻底的均质。
• 注意微生物的生长 ! 在收集和运送到实验室进行提取之前的时间内，微生物种群可能会随着它们在收集管中的生长而发生变化。有几件事你可以做，以确保增长不会发生使你的结果产生偏差:
* 使用样本存储试剂 (如 DNA/RNA Shield)
* 收集时溶解
* 收集后立即冻结样本 (尽管参阅上面关于存储和冻结 / 解冻偏差的警告)(图 1)
• 对于非常粘稠的样品或抑制物质含量较高的样品，考虑使用比通常更少的样品，以避免在 PCR 抑制剂中处理。
* 食草动物 (例如马和喂食谷物的老鼠) 的样本往往含有很高的碳水化合物和未消化的植物物质。考虑像处理植物一样处理这些样本，并在净化前进行预处理 CTAB 萃取来去除这些碳水化合物。
• 水样粪便需要通过移液管转移到裂解管中。
纯化
DNA 纯度对成功的下游分析至关重要。如果在隔离期间不确保样品没有污染物，将需要额外的处理步骤。
图 1：未保存的粪便与保存在 DNA/RNA Shield 层中的粪便相比，微生物剖面上的冻融偏差 (左图)。粪便标本收集于 PBS 或 DNA/RNA Shield 层中，反复冻融循环。随后提取 DNA，制备文库并进行 16S 靶向测序。
纯样品的秘密在于纯化方案的结合和洗涤步骤。大多数纯化试剂盒 (包括 Quick-Dna 粪便土壤微生物试剂盒) 中含有的结合剂是一种高度饱和的潮性盐溶液。虽然将 DNA 与纯化基质结合至关重要，但如果该试剂与 DNA 共洗脱，则会在 230 纳米处产生高吸收率，从而使纳米液滴测量结果发生偏差。此外，粪便样本可能含有高水平的多酚化合物，可共同提取 DNA。在使用聚合酶链反应 (PCR) 进行步骤之前，应注意确保这些物质被去除，因为它们会抑制该技术。
为避免这些问题，我们建议：
1. 在操作步骤的结合步骤中，不要过度填充柱。任何额外的结合缓冲液都可能使盐滞留在柱的边缘或顶部。此外，柱顶被过量装载的样品污染的可能性也更大。
2. 在洗涤步骤中，洗涤缓冲液应沿柱的边缘加载，而不是简单地将其喷射到柱中。沿着柱的内缘运行移液管尖端，有助于将盐从柱壁上洗去。
3. 将洗脱缓冲液直接放在基质上。用移液管将洗脱缓冲液移至柱上的任何其他位置，都可能导致任何残留盐的再悬浮。
4. 粪样中含有胆盐和与复合多糖，他们与 DNA1,2 相互作用，这些化合物抑制 PCR，因此需要在下游过程中去除 (图 2)。如果需要，洗脱的 DNA 应通过抑制剂去除柱，如一步法 PCR 抑制剂去除试剂盒 (OneStep PCR Inhibitor Removal Kits)
图 2：用一步法聚合酶链反应（pcr）抑制剂去除试剂盒处理含腐殖酸亲和力的 DNA，对 200 bp 产物进行聚合酶链反应（pcr）抑制剂去除的重要性。或者，对未经处理的样品完全抑制 PCR。
一步 PCR 抑制剂去除试剂盒
OneStep PCR Inhibitor Removal Kits
一步法 PCR 抑制剂去除试剂盒是 PCR 抑制剂清除试剂盒，包含所有有效去除污染物所需的成分，这些污染物可以抑制 DNA 和 RNA 制剂的下游酶反应 (如 PCR 和 RT)。这些 PCR 抑制剂净化试剂盒中的柱状基质是专门设计用于从最不纯净的 DNA 和 RNA 制剂中有效去除多酚类化合物、腐殖酸 / 黄腐酸、单宁、黑色素等。使用这些 PCR 抑制纯化试剂盒，样品纯化就像结合，纯化柱中回收样品一样简单。
如有相关产品问题，欢迎咨询 吕经理 13302085668
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