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提取 RNA 的实战技巧 速收藏！
人阅读 发布时间：2020-04-15 16:11
众所周知，RNA 提取是一项困难的工作。常见的挑战包括 RNA 降解、低产率和 / 或纯度以及 DNA 污染。此外，不同的样品类型有自己独特的特性，需要特别注意。例如，微生物 (如革兰氏阳性 / 阴性细菌、真菌、古生菌等) 的细胞壁坚硬，不易被化学和酶解。其他样本类型，如粪便和植物含有抑制剂 (如多酚类、腐殖酸 / 黄腐酸、单宁酸等)，可与 RNA 共沉淀，并可抑制下游分析，如 RT-qPCR。
下面，科学家分享了他们的 RNA 分离技巧，特别是最大限度地回收高质量、无 DNA 的 RNA 的实践经验。
收集样品后稳定 RNA
RNA 是不稳定的，极易降解。许多样品含有高水平的 RNase，会快速降解 RNA。为了使之最小化，最好在采集时稳定样本中的 RNA。常用的样品稳定方法包括液氮快速冷冻、干冰乙醇浴或-80°C 冷冻室。然而，这些方法也有缺点，如核酸的冻融损伤，并不是所有的研究人员在采集样品时都能立即使用这些方法。
最佳 RNA 稳定方法：
1. 在裂解缓冲液中立即溶解，使 RNase 失活 (如 TRIzol®、RNA 裂解缓冲液等)。然后样品可以立即处理或冷冻保存。
2. 浸泡在稳定试剂中 (如 DNA/RNA Shield)，使核酸酶失活，并在环境温度下长时间保护核酸。这对正在实地收集样本或处理珍贵的病人样本 (例如组织活检、全血等) 的研究人员特别有帮助。
确保样品完全溶解：
在 RNA 提取过程中，最大限度地提高 RNA 产量和质量的最佳方法是保证样品的完全裂解。然而，并不是所有的样本都对相同的裂解方案敏感。例如，血细胞 (如淋巴细胞、PBMCs 等) 和微生物细胞往往更难以有效地溶解。仅仅添加基于洗涤剂的裂解缓冲液可能并不总是足够的。为了提高裂解效果，可以将裂解缓冲液与机械裂解步骤 (研磨珠破碎) 匹配，或者在裂解液上游加入酶裂解步骤 (如蛋白酶 K、溶菌酶等)(图 1)。
图 1：从裂解缓冲液中提取大肠杆菌细胞的总 RNA，用捣碎珠 (样本 1-3) 机械匀浆，而不是仅用裂解缓冲液提取 (样本 4-6)。在裂解缓冲液中进行机械均质化可产生稳定的 28S/16S 核糖体带和更高的核糖体完整性 (RIN)。Agilent2200 TapeStation®。
此外，值得注意的是，完整的样品裂解也有助于提取过程的顺利进行。柱状萃取法不完全裂解可导致柱堵塞、缓冲液结转、DNA 污染和不完全洗脱。考虑到这一切，Zymo 研究已经竭尽全力为所有常见的样本类型优化最有效的裂解方案。
如何消除 DNA 污染
另一个与 RNA 提取相关的常见问题是 DNA 污染。DNA 的存在会使基于 UV/VIS 的定量方法 (如 Nanodrop) 发生偏差，从而人为地提高 RNA 的定量，使其高于实际水平。此外，在更敏感的下游应用 (例如 RNA-seq) 中，它还可能导致错误读数。为了确保您得到最准确的定量测量，并避免下游分析中的任何差异，消除任何 DNA 结转是很重要的。这可以通过多种方法实现 (例如 TRIzol®相分离、DNA 去除柱和 DNase 处理)。
确认 DNA 的存在的最快方法是使 RNA 样本可视化 (如琼脂糖凝胶 ,AgilentTapeStation®, 等等), 寻找 28S 核糖体 RNA 带上方的任何高分子量片段 (图 2)。其他方法 , 如 qPCR 或 Qubit 也可以使用，如果您正在执行对 DNA 污染敏感的下游应用，则更可取。
Zymo Research 开发了一种新型的 RNA 提取试剂盒，该试剂盒具有新的缓冲液和离心柱体系，可以结合和提取 RNA，同时消除污染的 DNA。相比之下，市场上的许多其他产品都是基于共纯化的，因此仍然存在高水平的 DNA 污染。最好的 RNA 分离试剂盒包括用于柱上处理的 DNase I。这消除了提取后 DNA 酶处理和清理步骤的需要，并简化了从提取到下游应用的过程。下面的图 3 说明了基于 PCR 缺乏 DNA 扩增，ZYMO 柱对 Dnase 处理是有效的。
图 2：用琼脂糖凝胶电泳显示人类上皮细胞的 RNA 谱。使用 ZYMO RESEARCH 试剂盒提取的 RNA 没有污染基因组 DNA，与供应商 Q 和供应商 P 相比，小 RNA 的回收率更高。
图 3：使用 Zymo Quick-RNA 试剂盒（绿色）分离的 RNA 与使用供应商 Q 试剂盒（虚线）分离的样品相比无 DNA。 从 106 个人上皮细胞中分离总 RNA（对于两种试剂盒均进行柱上 DNase 处理）。 每条扩增曲线代表三次独立分离实验的平均值。
掌握 RNA 提取
高质量的总 RNA 可以从任何样本类型中回收，记住三个简单的技巧:确保样本采集后稳定，彻底裂解样本，消除任何潜在的 DNA 污染。这些技巧将使 RNA 更容易回收适用于任何下游应用，并且每次都获得准确和可靠的下游结果，所有的产品，如上面列出的，可以简化提取过程，并得到免费的技术支持团队的支持，我们可以提供任何额外的建议，帮助任何人成为 RNA 提取大师 !
如有需求，可联系吕经理 13302085668
下面，科学家分享了他们的 RNA 分离技巧，特别是最大限度地回收高质量、无 DNA 的 RNA 的实践经验。
收集样品后稳定 RNA
RNA 是不稳定的，极易降解。许多样品含有高水平的 RNase，会快速降解 RNA。为了使之最小化，最好在采集时稳定样本中的 RNA。常用的样品稳定方法包括液氮快速冷冻、干冰乙醇浴或-80°C 冷冻室。然而，这些方法也有缺点，如核酸的冻融损伤，并不是所有的研究人员在采集样品时都能立即使用这些方法。
最佳 RNA 稳定方法：
1. 在裂解缓冲液中立即溶解，使 RNase 失活 (如 TRIzol®、RNA 裂解缓冲液等)。然后样品可以立即处理或冷冻保存。
2. 浸泡在稳定试剂中 (如 DNA/RNA Shield)，使核酸酶失活，并在环境温度下长时间保护核酸。这对正在实地收集样本或处理珍贵的病人样本 (例如组织活检、全血等) 的研究人员特别有帮助。
确保样品完全溶解：
在 RNA 提取过程中，最大限度地提高 RNA 产量和质量的最佳方法是保证样品的完全裂解。然而，并不是所有的样本都对相同的裂解方案敏感。例如，血细胞 (如淋巴细胞、PBMCs 等) 和微生物细胞往往更难以有效地溶解。仅仅添加基于洗涤剂的裂解缓冲液可能并不总是足够的。为了提高裂解效果，可以将裂解缓冲液与机械裂解步骤 (研磨珠破碎) 匹配，或者在裂解液上游加入酶裂解步骤 (如蛋白酶 K、溶菌酶等)(图 1)。
此外，值得注意的是，完整的样品裂解也有助于提取过程的顺利进行。柱状萃取法不完全裂解可导致柱堵塞、缓冲液结转、DNA 污染和不完全洗脱。考虑到这一切，Zymo 研究已经竭尽全力为所有常见的样本类型优化最有效的裂解方案。
如何消除 DNA 污染
另一个与 RNA 提取相关的常见问题是 DNA 污染。DNA 的存在会使基于 UV/VIS 的定量方法 (如 Nanodrop) 发生偏差，从而人为地提高 RNA 的定量，使其高于实际水平。此外，在更敏感的下游应用 (例如 RNA-seq) 中，它还可能导致错误读数。为了确保您得到最准确的定量测量，并避免下游分析中的任何差异，消除任何 DNA 结转是很重要的。这可以通过多种方法实现 (例如 TRIzol®相分离、DNA 去除柱和 DNase 处理)。
确认 DNA 的存在的最快方法是使 RNA 样本可视化 (如琼脂糖凝胶 ,AgilentTapeStation®, 等等), 寻找 28S 核糖体 RNA 带上方的任何高分子量片段 (图 2)。其他方法 , 如 qPCR 或 Qubit 也可以使用，如果您正在执行对 DNA 污染敏感的下游应用，则更可取。
Zymo Research 开发了一种新型的 RNA 提取试剂盒，该试剂盒具有新的缓冲液和离心柱体系，可以结合和提取 RNA，同时消除污染的 DNA。相比之下，市场上的许多其他产品都是基于共纯化的，因此仍然存在高水平的 DNA 污染。最好的 RNA 分离试剂盒包括用于柱上处理的 DNase I。这消除了提取后 DNA 酶处理和清理步骤的需要，并简化了从提取到下游应用的过程。下面的图 3 说明了基于 PCR 缺乏 DNA 扩增，ZYMO 柱对 Dnase 处理是有效的。
图 2：用琼脂糖凝胶电泳显示人类上皮细胞的 RNA 谱。使用 ZYMO RESEARCH 试剂盒提取的 RNA 没有污染基因组 DNA，与供应商 Q 和供应商 P 相比，小 RNA 的回收率更高。
掌握 RNA 提取
高质量的总 RNA 可以从任何样本类型中回收，记住三个简单的技巧:确保样本采集后稳定，彻底裂解样本，消除任何潜在的 DNA 污染。这些技巧将使 RNA 更容易回收适用于任何下游应用，并且每次都获得准确和可靠的下游结果，所有的产品，如上面列出的，可以简化提取过程，并得到免费的技术支持团队的支持，我们可以提供任何额外的建议，帮助任何人成为 RNA 提取大师 !
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